Imuno Histocit - imunohistochimie la un alt nivel

Metoda de lucru utilizată la Laboratorul de Imunohistochimie

„IMUNOHISTOCIT” Odorheiu- Secuiesc


Asistent şef histopatolog: Mihály Levente  0745-756151
Asistent: Boda Lajos  0725-538039
Medic: Dr. Fehér István M.D.D.Sc. 0740-314934

1. Fixarea pieselor se face în formol neutru maximum 24h. Dimensiunea pieselor prelevate nu depăşesc 8-10x8-10x4-5 mm. Pentru biopsiile mici un timp de fixare de 6h este suficient.
2. Secţiuni de 3-4 microni, perfect întinse fără pliuri în apă distilată de 37oC etalate pe lame silanizate sau tratate cu gelatină cromică (folosim numai în cazuri excepţionale). Secţiunile sunt uscate la 37oC  în termostat sau la temperatura camerei timp de 24h.
3. Deparafinarea: Xilen 3x10 min.
4. Rehidratarea: etanol 3x3 min., apă distilată 1x5 min.
5. Demascaţia antigenică a secţiunilor se face prin fierbere, 3x5 min.într-un vas cu  soluţie Histols citrat tampon 0,01 M cu pH 6 (cat.30010) într-un cuptor cu microunde la o putere de 750 W. Nivelul soluţiei de tampon este verificat după fiecare 5 minute, iar cantitatea evaporată se completează cu soluţie tampon citrat de sodiu (aceeaşi soluţie pe care o folosim şi la fierbere).
6. Răcirea secţiunilor în apă distilată la temperatura camerei timp de 5 min.
7. Blocarea peroxidazei endogene timp de 10 min. (90 ml apă distilată+5 ml perhidrol conc.)
8. Spălare cu apă distilată 5 min.
9. Spălare cu soluţie tampon PBS (pH 7,2 - 7,6) 3-5 min.

Începând de la punctul 10 se lucrează în cameră umedă.

10. Blocarea nespecifică pentru reducerea „zgomotului de fond” cu BBPS – Histols 10 min. (în loc de BSA sau lapte de praf 3% cum se făcea înainte) BBPS Histols – backround blocking protein solution cat. 30012.
11. Aplicarea anticorpului primar – folosim diluţiile indicate de firma producătoare într-o cantitate de 80 microlitri. În cazul secţiunilor obţinute prin tehnica TMA cantitatea serului aplicat este semnificativ mai mică. Diluarea anticorpului primar se face cu Large Volume UltraAB Diluent (LabVision cat. TA-125-UD). Aplicarea anticorpului se face prin simpla aplicare  într-o cantitate suficientă care să ajungă limitele marcate cu Histo Pen (după prima rehidratare cu soluţie tampon secţiunile vor fi încercuite, demarcate cu Histo Pen cat. 30020 Tissue Marker Hydrophobic Pen).
12. Incubare la temperatura camerei timp de 60 min.
13. Spălarea cu soluţia tampon PBS 3x5 min.
14. Aplicarea polimerului însemnat Histols-MR (cat. 30011500 anti şoarece şi iepure timp de 30 min).
15. Spălare cu soluţie tampon PBS 3x5 min.
16. Aplicarea Histols-DAB cat 30014, soluţia de lucru (o picătură 40 microlitri DAB+1ml substrat )se prepară extemporaneu şi poate fi folosită la temperatura camerei timp de 6 ore. Intensitatea coloraţiei se verifică sub microscop timp de 3-10 min.şi este oprit după obţinerea intensităţii dorite prin punctul 17.
17. Spălare cu apă distilată 10-15 min.
18. Supracolorare cu Hematoxilină: un timp mai scurt de coloraţie obişnuită (aproximativ jumătate din timpul coloraţiei de rutină).
19. Deshidratare: alcool 96o .1x30 sec. alcool absolut 1x30 sec. şi acetonă 1x30 sec.
20. Clarifiere: xilen 3x3 min.
21. Montare: balsam de Canada, care se poate utiliza şi în cazul cromogenului Histols – restistant AEC

Prezentare DominoStainer

 

Click aici pentru mai multe informatii